Mechanism of a drug pair of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum on ulcerative colitis based on network pharmacology
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摘要: 黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的临床疗效确切，然而作用机制不明. 采用网络药理学技术研究黄芪−枸杞子配伍抗溃疡性结肠炎的潜在作用机制. 利用整合药理学平台、String数据库、David 数据库等系统检索中药化学成分和候选靶标，通过分析药物和疾病蛋白靶标互作关系，筛选关键靶标并进行基因GO功能和KEGG通路富集分析，构建“中药−核心成分−关键靶标−主要通路”多维调控网络. 结果表明，黄芪−枸杞子可能通过作用于前列腺素 G/H 合成酶 2 (PTGS2) 等蛋白靶标，参与核转录因子(NF-κВ)、肿瘤坏死因子 (TNF) 等多个炎症和免疫相关信号通路，发挥抗溃疡性结肠炎作用. 研究结果为系统阐明黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的作用机制提供参考.Abstract: The drug pair comprising of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum (AL) has the clinical efficacy to prevent ulcerative colitis (UC). However, the mechanism of action is still arcane. The possible mechanism of this drug pair in the treatment of UC was investigated using a network pharmacology platform. The components and putative targets of AL were collected based on integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine, String database, and David database. By analyzing the protein-protein interactive network containing the targets of AL and potential therapeutic targets of UC, GO and KEGG pathway enrichment analyses were performed, and a regulating network of herb-constituent-target-pathway was constructed. The results suggested that AL may play a beneficial role in UC through affecting the expression of targets associated with immune and inflammation such as PTGS2, and regulation of nuclear transcription factor-κВ signaling pathway, TNF signaling pathway, etc. The results of the study provide a reference for the systematic elucidation of the mechanism of AL in the treatment of UC.
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溃疡性结肠炎 (Ulcerative Colitis，UC) 是一种由多种因素引起的炎症性肠病，临床主要表现为持续性或反复性发作的腹痛、腹泻、黏液脓血便等[1]，病况反复迁延，且有癌变风险[2]. 目前，关于溃疡性结肠炎的发病机制尚不明确，通常认为与遗传和环境因素引起的肠道微生物组成变化和肠黏膜屏障损伤有关. 现有的治疗药物主要包括柳氮磺吡啶水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂[3]. 这些药物可以暂时缓解症状，但是容易引起消化道出血、皮疹、代谢紊乱、白内障、青光眼等多种副作用，此外还可能引发一系列感染.
溃疡性结肠炎属中医学“痢疾”范畴. 中医药疗法在促进肠黏膜恢复、缓解临床症状、减少复发方面有独特优势. 据文献报道，在我国有超过20%的溃疡性结肠炎患者采用纯中药治疗，59%患者采用中西医结合治疗[4]. Zhao等[5]研究发现，补气养阴类民间经方黄芪−枸杞子药对可显著改善溃疡性结肠炎大鼠体重、腹泻及结肠黏膜损伤，有效促进肠上皮细胞增殖. 但由于化学成分复杂，关于黄芪−枸杞子配伍治疗溃疡性结肠炎的作用机制尚未见报道.
网络药理学 (network pharmacology)[6]是基于系统生物学理论，通过对生物系统的网络分析，从整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导新药发现的新学科. 相比以往“一个药物、一种基因、一种疾病”的新药研发模式，网络药理学技术为多成分、多靶点、多通路互作的复杂药物的作用和机制研究提供了强有力的手段[7]. 本研究运用网络药理学技术，系统挖掘黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的关键靶点和相关信号通路，探讨可能的作用机制，为两药配伍抗溃疡性结肠炎的循证研究提供参考数据.
1. 数据来源与方法
1.1 中药化学成分及候选靶点
通过整合药理学平台(Integrative Pharmacologybased Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP)(http://www.tcmip.cn/)[8-9] 的“中药材数据库”“中药成分数据库”“中药靶标数据库”“疾病相关分子库”等数据库资源，检索中药黄芪和枸杞子所有化学成分及相关靶点，并收集溃疡性结肠炎相关基因和蛋白靶点，对中药成分及相关靶点进行功能分析. 以两倍“节点连接度”中位数为卡值，选取中药成分靶标和疾病基因互作网络的核心节点，根据“节点连接度”“节点紧密度”“节点介度”3个拓扑结构特征值，筛选黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的关键作用靶标.
1.2 蛋白互作网络构建
通过 Uniprot 数据库 (http://www.uniprot.org/) 对收集的基因信息和蛋白靶点进行校正，物种设置为 Human，获得各靶点的Uniprot ID. 将上述靶点导入String 数据库(https://string-db. org/)，获得关键靶点蛋白互作 (Protein-Protein Interactive, PPI) 关系数据，进一步利用 Cytoscape 3.7.1软件 (https://cytoscape.org/) 构建PPI可视化网络.
1.3 基因功能和信号通路富集分析
将黄芪−枸杞子配伍调控溃疡性结肠炎的关键靶点导入DAVID 数据库 (https://david. ncifcrf. gov/)，设置物种及背景为Homo sapiens (Human)，进行基因本体(Gene Ontology，GO) 功能富集和京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 信号通路富集分析，获得黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎关键网络靶标的基因功能及参与的信号通路.
GO 富集分析主要包括生物过程 (BiologicalProcess，BP)、细胞组成 (Cellular Component，CC)和分子功能 (Molecular Function，MF) 3个部分，分别按照 p 值筛选排名前30位的条目进行分析. KEGG 富集分析按照 p 值选取排名前 30 位的条目进行分析，并将富集分析结果可视化.
1.4 “中药−核心成分−关键靶点−主要通路”多维调控网络构建
利用 TCMIP 平台的网络药理学计算模块，构建“中药−核心成分−关键靶点−主要通路”多维调控网络，挖掘黄芪−枸杞子配伍抗溃疡性结肠炎的关键靶点和主要信号通路.
2. 结 果
2.1 黄芪−枸杞子药对的化学成分及候选靶标筛选
本研究收集黄芪和枸杞子化学成分共计89个. 黄芪中29种化学成分对应基因和蛋白靶点77个，枸杞子中60种化学成分对应蛋白靶点229个，其中，23种蛋白靶点为两药共有靶点. 对中药成分潜在靶标的基因功能进行分析，发现主要涉及氧化还原过程、线粒体、内质网膜、L−抗坏血酸结合、铁离子结合、胞外甘氨酸门控氯通道活性、磷脂及磷脂酰胆碱生物合成等.
2.2 黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的候选靶标相互作用分析
利用TCMIP 数据库的网络计算技术，根据网络拓扑特征值，筛选黄芪−枸杞子抗溃疡性结肠炎的候选靶标，构建候选靶标相互作用网络，如图1所示. 此网络中包含146个节点和510条边，分别代表候选靶标及其相互作用. 节点大小代表连接度 (degree)大小. 表1显示了连接度 > 10的23个关键靶标的网络拓扑特征参数.
图 1 黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的候选靶标相互作用网络Figure 1. Candidate target interaction network of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC表 1 黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎关键靶标的网络拓扑特征参数Table 1. Network topological parameters of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC序号 关键网络靶标 连接度 紧密度 介度 序号 关键网络靶标 连接度 紧密度 介度 1 PRKCD 37 0.477 16.490 13 PLD2 16 0.416 3.337 2 BDKRB2 26 0.397 2.986 14 NPR2 15 0.405 2.431 3 NFKB1 26 0.424 6.872 15 PTGS2 14 0.377 2.389 4 IL10 25 0.422 6.146 16 IL10RB 13 0.395 1.694 5 CD19 25 0.419 3.396 17 RET 12 0.378 3.653 6 ICAM1 24 0.405 3.299 18 IL10RA 12 0.345 0.062 7 ADORA3 22 0.376 0 19 PLD1 11 0.334 0.142 8 IFNG 22 0.414 1.198 20 PPARG 11 0.367 1.135 9 CCR9 21 0.375 6.438 21 QPRT 10 0.343 0.153 10 PLCG2 19 0.383 6.306 22 TRAF6 10 0.351 2.340 11 MS4A1 18 0.396 2.087 23 TERT 10 0.390 3.559 12 NFKB2 17 0.393 4.493 2.3 GO功能富集分析
通过DAVID数据库对2.2中描述的关键靶标进行 GO 功能富集分析. 以p < 0.05、FDR < 0.05为筛选条件，共获得BP相关条目217个，CC 相关条目20个，以及MF 相关条目43个. 各取排名前10位的条目，结果如图2所示. BP相关前10位条目主要涉及凋亡过程负调控、蛋白质磷酸化、G蛋白偶联受体信号通路等；CC 相关前 10位条目主要涉及质膜、核质等；MF相关前10位条目主要涉及ATP结合、蛋白激酶活性、转录因子结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等.
图 2 黄芪−枸杞子治疗溃疡性结肠炎关键靶标的GO功能富集分析图Figure 2. GO network enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC2.4 KEGG通路富集分析
对黄芪−枸杞子抗溃疡性结肠炎的关键靶标进行 KEGG 通路富集分析，以p < 0.05、FDR < 0.05为筛选条件，共获得相关信号通路125个. 按照p值取前30个重要通路，结果如图3所示. 主要涉及趋化因子信号通路、PI3K-Akt 信号通路、JAK/STAT 信号通路、Toll 样 受 体 (Toll-Like Receptors, TLRs) 信号通路、肿瘤坏死因子 (TNF) 信号通路、核转录因子 (NF-κB) 信号通路、HIF-1 信号通路等重要免疫和炎症相关通路. 此外，也与一些癌症通路、cGMP-PKG信号通路、鞘脂类信号通路、雌激素信号通路等有关.
图 3 黄芪−枸杞子治疗溃疡性结肠炎关键靶标的KEGG通路富集分析图Figure 3. KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC2.5 “中药−核心成分−关键靶点−主要通路”多维调控网络分析
黄芪−枸杞子治疗溃疡性结肠炎的“中药−核心成分−关键靶点−主要通路”相互作用网络如图4所示. 此网络中包含40个节点和74条边，涉及9个潜在活性成分、11个作用靶点及18个信号通路. 结果表明，黄芪−枸杞子药对活性成分可通过作用于磷脂酶D1/2 (PLD1/2)、前列腺素 G/H 合成酶 1/2 (PTGS1/2)、过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARG)、趋化因子CCL8、腺苷A3受体 (ADORA3) 等关键靶点，参与NF-κB、TNF、趋化因子、T细胞受体 (TCR)、B细胞受体 (BCR) 等免疫和炎症相关重要信号通路，发挥治疗溃疡性结肠炎作用.
图 4 “中药−核心成分−关键靶点−主要通路”多维调控网络关系图Figure 4. "Herb-composition-target-pathway" multidimensional network diagram3. 结 语
本研究基于网络药理学方法，研究黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的活性成分和可能的作用机制，结果显示两药配伍可能通过调节多个免疫和炎症相关信号通路发挥抗UC作用. 黄芪中活性成分毛蕊异黄酮 (Calycosin)、异鼠李素 (Isorhamnetin) 等可作用于PTGS2发挥治疗溃疡性结肠炎作用[10]；PTGS2 (COX-2) 是一种可诱导酶，介导前列腺素的合成，在炎症反应中起着重要的作用. 实验研究证实，黄芪多糖也可减少调节核因子-κB (NF-κВ) DNA磷酸化活性，并下调肿瘤坏死因子 (TNF-α) 和白介素 (IL-1β, IL-6, IL-17) 等多种炎症因子表达[11]. 同时，研究表明枸杞子提取物可降低右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎小鼠的趋化因子 (C-X-C motif) 配体1和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 以及炎症介质白介素-6 (IL-6) 和环氧化酶-2 (COX-2) 表达[12]. Sharma等[13-14]报道了枸杞子提取物通过NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 等信号通路和激酶的表达，抑制肠道炎症，促进肠黏膜损伤修复. 这些研究从不同角度验证了本研究发现. 后续将基于网络药理学分析结果，对筛选出的关键靶点和信号通路继续开展细胞及动物水平的实验验证，全面揭示黄芪−枸杞子配伍通过调节炎症与免疫治疗溃疡性结肠炎的分子机制，为中医药抗溃疡性结肠炎的基础和临床研究提供科学数据.
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图 1 黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎的候选靶标相互作用网络
Figure 1. Candidate target interaction network of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC
图 2 黄芪−枸杞子治疗溃疡性结肠炎关键靶标的GO功能富集分析图
Figure 2. GO network enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC
图 3 黄芪−枸杞子治疗溃疡性结肠炎关键靶标的KEGG通路富集分析图
Figure 3. KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC
图 4 “中药−核心成分−关键靶点−主要通路”多维调控网络关系图
Figure 4. "Herb-composition-target-pathway" multidimensional network diagram
表 1 黄芪−枸杞子药对治疗溃疡性结肠炎关键靶标的网络拓扑特征参数
Table 1. Network topological parameters of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC
序号 关键网络靶标 连接度 紧密度 介度 序号 关键网络靶标 连接度 紧密度 介度 1 PRKCD 37 0.477 16.490 13 PLD2 16 0.416 3.337 2 BDKRB2 26 0.397 2.986 14 NPR2 15 0.405 2.431 3 NFKB1 26 0.424 6.872 15 PTGS2 14 0.377 2.389 4 IL10 25 0.422 6.146 16 IL10RB 13 0.395 1.694 5 CD19 25 0.419 3.396 17 RET 12 0.378 3.653 6 ICAM1 24 0.405 3.299 18 IL10RA 12 0.345 0.062 7 ADORA3 22 0.376 0 19 PLD1 11 0.334 0.142 8 IFNG 22 0.414 1.198 20 PPARG 11 0.367 1.135 9 CCR9 21 0.375 6.438 21 QPRT 10 0.343 0.153 10 PLCG2 19 0.383 6.306 22 TRAF6 10 0.351 2.340 11 MS4A1 18 0.396 2.087 23 TERT 10 0.390 3.559 12 NFKB2 17 0.393 4.493 
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